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《Adv Sci》:軟骨內成骨雙重調節的三維生物打印各向異性支架重建肱骨頭

時間:2023-03-13 15:15 來源:EngineeringForLife 作者:admin 閱讀:
      組織工程學在理論上被認為是一種很有前途的重建生物關節的方法,因此為晚期骨關節炎的治療提供了一種潛在的選擇。然而,到目前為止,在大型生物關節的再生方面還沒有取得重大進展。最近,上海交通大學醫學院附屬新華醫院骨科朱俊峰在《Advanced Science》上發表了題為Regeneration of Humeral Head Using a 3D Bioprinted Anisotropic Scaffold with Dual Modulation of Endochondral Ossification的文章。研究者利用三維打印技術,設計并一步制作了一種兔子肱骨頭再生仿生支架,促進了軟骨下骨再生。
       研究者首先使用激光獲取了兔近端肱骨關節的形態,并設計了一種解剖學上正確的仿生支架,然后利用多噴嘴3D打印系統,制備了具有不同生化線索和不同結構的滑膜關節支架,如圖1所示。


圖1 基于CAD/CAM技術構建了不同結構和組成的兔肱骨頭支架

隨后,研究者進行了生物相容性研究,培養1、3、5、7d后,BMSCs均勻分布于支架內(圖2A)。各組間細胞存活率都很高(超過95%),統計分析表明不同組之間沒有顯著差異(圖2B)。此外,細胞增殖能力隨培養時間增加而增強。這些結果表明所制備的生物支架具有良好的生物相容性,可用于細胞的長期生長。

圖2 激光共聚焦掃描檢測支架的生物相容性

研究者結合不同的生化線索(甲狀旁腺激素[PTH]和化學成分羥基磷灰石[HA]分別位于內外區域)用于軟骨內成骨的雙重調節。外區動態機械刺激聯合生長因子PTH抑制軟骨內成骨,促進軟骨再生;內區動態機械刺激聯合HA促進軟骨內成骨,促進軟骨下骨再生。

經逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測,動態加壓和生化刺激組的相關基因表達最高(圖3B-D),且生物力學刺激的基因促進效果要高于生化刺激組。

結果表明,動態機械加壓復合PTH雙刺激支架能更好地誘導BMSCs向軟骨細胞分化,抑制軟骨內成骨,而動態機械加壓復合羥基磷灰石(HA)則刺激軟骨內成骨過程,有利于BMSCs的體外成骨。


圖3 模擬柱狀支架上軟骨層和下軟骨下骨層軟骨內成骨相關基因的表達

為了從蛋白質水平進一步評價生物3D打印支架對骨髓間充質干細胞軟骨內成骨過程的調控作用,研究者在體外培養30d后對不同支架的外層和內層進行了Col-II和Col-X的免疫熒光染色。如圖四所示,雙刺激組顯著高于單刺激組高于無刺激組,與基因檢測結果一致,表明在甲狀旁腺素動態加壓的協同作用下,抑制了BMSCs的軟骨內成骨和成軟骨能力,而在生物力學刺激和HA誘導的聯合作用下,顯著促進了軟骨內成骨的發展。


圖4 體外刺激后Col-II和Col-X的免疫熒光分析

進一步平均不同刺激物對軟骨再生的促進作用,組織學分析顯示,非刺激組表面僅見少量散在的軟骨組織。相反,染色顯示支架表面生成的軟骨組織的厚度和覆蓋率逐漸增加(圖5)。

在生化、生物力學和雙重刺激組中。雙刺激組表層再生較厚、連續的軟骨,有較好的ECM沉積,SO/FG染色顯示軟骨基質增多,HE和Masson染色顯示細胞填充良好。相比之下,生化組和生物力學刺激組的軟骨較薄。


圖5 各組體外刺激后肱骨頭硬組織切片的組織學觀察

接下來研究者對肩關節進行X光和MRI掃描,以評估植入的肱骨頭修復的固定和再生組織的形成(圖6)。從新生骨密度、再生肱骨形狀、是否脫位等方面,雙刺激組最好,單刺激組次之,均優于無刺激組。


圖6 植入支架后4個月拍攝肩關節X線片和MRI照片

最后研究者對體內再生肱骨頭的炎癥、組織學和力學評價,得到了雙刺激組炎癥下降最明顯的結論。并在4個月后對動物實施安樂死,并收集標本進行大體觀察。結果顯示,在無刺激組中,殘留的肱骨頭支架中新形成的組織大部分為纖維化組織,幾乎沒有軟骨和骨再生。且從視覺組織學評估量表、機制密度、軟骨體積等方面,雙刺激組結果均最好(圖7)。

再軟骨下區域,再生骨量在雙刺激組中最高,其次是生物力學組、生化組(圖 8A),并且沒有刺激組。骨體積/總體積比(BV/TV)、骨表面/骨體積比(BS/BV)和成骨細胞數量的定量分析進一步驗證了這一趨勢(圖8B-D)。

這些結果表明,生物力學刺激促進了再生軟骨組織的軟骨內骨化過程,加速了成熟骨組織的形成。


圖7 體內半肩關節置換術后肱骨頭軟骨再生的組織學檢查


圖8 體內半肩關節置換后肱骨頭軟骨下骨再生的組織學檢查

綜上,研究者展示了一種3D生物打印支架,具有各向異性結構和類似于天然肱骨頭的異質成分。通過動態壓縮和調節軟骨內骨化的生化線索的雙重刺激,實現了透明軟骨和軟骨下骨的各向異性再生。這種方法還為設計和制造具有臨床相關尺寸的解剖學上匹配的大型植入物提供了替代方案。

文章來源:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202205059

(責任編輯:admin)

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