高血糖及其誘導的氧化應激微環境對糖尿病骨缺損的修復提出了巨大的挑戰。上海工程技術大學朱同賀教授團隊、武漢理工大學戴紅蓮教授團隊和武漢大學中南醫院李景峰教授團隊聯合開發了一種用于糖尿病骨缺損修復的新型TZGP (α-TCP/ZnO/GM@P2) 復合支架。該文章名為: "A  Triple-Integrated 3D-Printed Composite Scaffold of High-Activity  Peptide-Metal Ion-Bone Cement Facilitates Osteo-Vascular Regenerative  Repair of Diabetic Bone Defects" 發表在ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS上。表征結果表明，α-TCP水泥支架、ZnO納米顆粒和負載和保護P2  (一種新型甲狀旁腺激素相關肽)  的明膠微球實現了互補的優勢。TZGP支架在滿足松質骨的機械強度要求的同時，彌補了無機支架中生物活性肽的不足。它的生物相容性得到增強，并且支架具有抗菌和抗氧化特性。體外和體內結果表明，TZGP支架釋放活性因子P2和Zn2+，在高葡萄糖微環境中促進細胞增殖和募集，減少細胞活性氧積累，改善DNA損傷和線粒體穩態，并誘導成骨血管生成分化。與傳統的α-TCP   支架相比，TZGP支架表現出更優異的生物降解性，加速局部組織充盈，促進糖尿病骨缺損的骨堆積和血管重建。因此，TZGP支架的新穎設計策略為修復糖尿病骨缺損提供了一種很有前途的方法。
 
一、背景介紹
糖尿病(DM)是常見疾病，全球超十分之一成年人患病，作為全身性代謝內分泌紊亂疾病，其以高血糖為特征，引發骨代謝調節劑表達失調等病理微環境變化，破壞骨代謝穩定，增加骨質疏松和骨折發生率，還導致線粒體功能障礙，給糖尿病患者骨缺損和骨折修復帶來挑戰。
在骨組織工程中，磷酸鈣是常用的骨缺損修復材料，如α-磷酸三鈣(α-  TCP)骨水泥和β  -磷酸三鈣(β-TCP)煅燒支架，生物相容性良好。但單個TCP相生物降解性有限、機械性能不佳、骨誘導性不足、缺乏促血管構建因子，難以促進糖尿病患者骨缺損愈合。β-TCP支架靠煅燒燒結制備，藥物負載為仿生涂層，限制藥物釋放量和持續時間。α-TCP生物降解和吸收更快，室溫下與弱酸性液體接觸會反應形成鈣磷石并提供機械強度，還能添加溫敏藥物，但降解早期釋放的弱酸性物質不利骨修復，本研究添加氧化鋅納米粒子(ZnONPs)調節  pH 值，其降解產生的 Zn²⁺還能促進成骨。

甲狀旁腺激素(PTH)參與骨轉化和鈣磷代謝，有促進骨形成、血管化及骨吸收等作用。臨床主要靠間斷皮下注射全身給藥，卻存在劑量大、半衰期短、局部藥物濃度難維持、局部應用受限等問題。前期研究發現，PTH相關肽-2(P2)可低成本大量合成。與PTH   (1-34)相比，P2鈣磷組織錨定能力更優，局部藥物滯留時間長，還能避免藥物突發釋放導致的高骨吸收。表面功能化的P2支架材料，成骨和血管生成誘導能力比PTH   (1-34)更好，破骨細胞分化作用較弱，利于骨量累積。不過，直接把P2混入骨水泥易破壞其結構和活性，難以有效載藥，而以明膠微凝膠(GMs)作為P2遞送載體，能起到保護和控制P2釋放的作用。

本研究擬采用α-TCP-ZnONP-P2復合的新策略，巧妙地將有機活性肽、無機支架和金屬離子整合在一起，制備出一種新型的3D多功能復合支架(TZGP支架)。從材料組分的角度看，TZGP支架各組分將優勢互補，顯著地改善了單純TCP支架降解速度慢、缺乏生物活性肽、存在酸性降解產物等不利因素。從材料功能的角度看，改善了單純TCP支架降解慢、缺生物活性肽、有酸性降解產物等不足。在功能上，TZGP支架滿足松質骨機械強度要求，生物相容性、生物降解性、抗菌性和抗氧化能力更出色，能通過強大的成骨  - 血管生成作用，促進糖尿病骨缺損的修復(圖1)。

 
圖  1.  活性肽-金屬離子-骨水泥三重集成3D打印復合支架示意圖用于糖尿病骨缺損的骨血管再生修復。GMs：明膠微凝膠；P2：甲狀旁腺激素相關肽-2；GP：負載P2的GM；Alg：海藻酸鹽；STZ：鏈脲佐菌素；ROS：活性氧；MMP：線粒體膜電位；OB：成骨細胞；BMSC：骨髓間充質干細胞；VEC：血管內皮細胞。 二、材料與方法2.1 3D打印TZGP復合支架的制作將α-TCP粉末(3g)、ZnONPs(2% w/v)和GMs(5% w/v)或GPs(5%w/v)加入10% w/v Alg凝膠中。進行機械攪拌直至形成糊狀以獲得打印墨水。根據表1中的組成制備四種不同的復合支架，T、TZ、TZG和TZGP支架。復合支架在3D打印機(SunP BioMaker 2)上打印。3D打印機噴嘴直徑為500 μm，螺桿擠出速度為0.5-1 mm3s-1，打印速度為5-15 mm-1 s-1。將打印好的支架毛坯浸入10%磷酸溶液中5分鐘進行交聯反應，然后用去離子水沖洗3次，快速真空干燥，并在-20°C下儲存。 三、結果3.1 3D 打印復合支架的表征本研究以GM作為P2的藥物遞送載體，在3D打印復合支架的制備過程中，為P2提供保護殼。GM的制備如圖2A所示，交聯前的明膠粉末呈較大尺寸的不規則塊狀(圖2B)。成功制備的GM為規則、多孔的球形小顆粒(圖2B)。  粒徑分布范圍為10–70 μm，集中在35–50 μm，平均直徑為41.33 ± 9.13 μm(圖2C)。α-TCP無毒、具骨傳導性和生物活性，降解吸收快。TCP/ZnONP/GM   (TZG)復合支架在室溫下的制備過程如圖2D所示。流變測試顯示其打印油墨高粘度低剪切力，有良好自修復能力和剪切變稀特性，具備可擠出性和可打印性(圖2E、2F)。X射線衍射儀(XRD)結果表明，凝固的純α-TCP(T)支架中的主要晶相為磷灰石。TZ和TZG復合支架的特征峰與純TCP支架的特征峰基本相同，說明ZnONPs和GM的加入對TCP的固化產物沒有影響(圖2G)。T支架的初始降解產物呈弱酸性，而ZnONP是堿性物質，可與H+反應釋放Zn2+。連續   pH測定表明，ZnONP的引入略微增加了TZ的pH值，并且TZG支架。TZ和TZG支架的pH值比T支架更接近中性和生理環境(圖2H)。Zn2+的釋放動力學表明，TZ和TZG支架在前3周內均可穩定釋放Zn2+(圖2I)。TZG支架釋放的Zn2+濃度略高于TZ支架。連續8周的測試表明，所有三組支架均表現出正降解。與T和TZ支架相比，TZG支架表現出更好的降解效果(圖2J)。這可能是因為引入GM導致TZG的降解速度略快于TZ支架。SEM結果顯示了TZG支架隨時間降解后的形態。支架降解后，支架內部的GM會顯露出來，為新生骨組織提供攀爬和交聯的空間。打印支架浸入弱酸性溶液中發生的凝固反應為支架提供了基本的機械強度。在α-TCP凝固過程中，溶解的Ca2+會與支架中的海藻酸鈉螯合，進一步增強支架的機械強度。TZ支架的抗壓強度(23.34  ± 1.80 MPa)與T支架(24.17 ± 1.55 MPa)相比沒有明顯變化，而TZG的抗壓強度(14.53 ± 1.27  MPa)下降更為明顯(圖2K)。GM的引入可能會降低支架的致密性，可能是復合支架機械性能下降的原因。幸運的是，它仍然能夠滿足松質骨的要求(4-12  MPa)。通過顯微鏡連續觀察發現，由于吸水，PBS中的GM直徑增大，然后逐漸降解，28天內降解率超過90%，僅剩下少量顆粒。ZnONPs是強效抗菌劑，可直接損傷細菌細胞膜上的蛋白質和脂質，導致細菌細胞內內容物泄漏和死亡。ZnONPs和Zn2+還可以穿過受損的膜，破壞細胞內部功能，導致細菌死亡。根據SEM圖像，ZnONPs的平均粒徑為30.33  ± 7.30  nm。在本研究中，通過擴散板法驗證了ZnONPs的引入賦予TZ和TZG支架一定的抗菌性能(圖2L)，這有利于預防糖尿病骨缺損中的局部細菌感染。 圖2.  T、TZ和TZG支架的表征。A) GM制備示意圖。B)明膠和GM的SEM。C) GM的粒度分布。D) TZG支架制備示意圖。E、F)  TZG墨水的流變測試。G) XRD和H) T、TZ和TZG支架的pH值(n = 3)。I) TZ和TZG支架中Zn2+的釋放動力學(n =  3)。J)降解曲線(n = 5)、K)抗壓強度(n = 5)和L) T、TZ和TZG支架的抗菌性能測試。
3.2 復合支架的生物相容性研究發現，ZnONPs能通過重新分配電子密度展現強大抗氧化活性。在本研究中，TZ 和 TZG支架的氮自由基清除能力比T支架顯著提高，說明ZnONPs賦予復合支架抗氧化性。P2負載示意圖如3A所示。利用GM的溶解性、多孔性和吸附特性，將P2摻入GM(GP)中。P2的平均負載效率為95.38%  ±  1.37%。通過免疫熒光顯微鏡可以看到負載有異硫氰酸熒光素(FITC)標記的P2(P2FITC)的GP發出明亮均勻的綠色熒光(圖3A)，并且GP保持相對規則的球形。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結果表明，GM和GP都在1700–1500  cm-1區域形成了兩個不同的酰胺I和酰胺II帶。此外，GP在1540和1453  cm−1處的振動峰更加突出，并且伯酰胺基團的NH2的搖擺振動更加明顯，出現在≈1158和594  cm−1。zeta電位測量表明P2帶負電荷，GM帶正電荷，GP的正電荷減少，這意味著P2在GM上的錨定進一步通過正負電荷之間的靜電吸引力得到加強，從而促進了P2從GP中緩慢釋放(圖3B)。P2從GP中的釋放曲線在前5天內表現出初始快速釋放階段，隨后是緩慢釋放期(圖2C)。GP與GM在形態上沒有差異，GM本身不具有生物活性，因此后續分析僅對T、TZ和TZGP支架進行了評估。從宏觀角度看，ZnONPs的加入使支架的顏色更白，而GP的加入使支架的顏色略帶黃色(圖3D)。SEM結果顯示，與T和TZ支架相比，TZGP支架表面更粗糙，形成更多的微孔結構(圖3E、H)，有利于細胞粘附和增殖。從一些微孔結構中可以觀察到嵌入的GP(圖3F)，這為P2的釋放提供了窗口。得益于C端三個連續谷氨酸的改善，P2的鈣磷基質錨定能力增強(圖3N)。這無疑有利于P2在支架和骨組織局部的作用時間，延長半衰期。EDS結果顯示TZGP支架內Ca、P、Zn分布均勻(圖3G)。  
活/死細胞染色結果顯示3   組支架共培養3天后活細胞比例超90%(圖3I、J)，表明均具有良好的生物相容性。但TZ和TZGP組骨髓間充質干細胞(BMSCs)平均鋪展面積大于T組(圖3K、L)，表明TZ和TZGP支架更利于細胞黏附。CCK  - 8結果表明，TZGP組細胞增殖比T和TZ組更明顯(圖3M)。 圖3.  支架的生物相容性。A) GP示意圖及免疫熒光圖。B) P2、GMs、GP的Zeta電位。C) P2釋放曲線及GM降解曲線。D)  支架宏觀形貌及E) SEM。F) 光學顯微鏡下的TZGP支架。箭頭指向GP。G) TZGP支架的EDS。H)  TZGP支架局部放大SEM圖像。箭頭指向GP。I)活/死細胞染色及J)細胞活力定量分析(活細胞比例=綠細胞/(綠細胞+紅細胞)×  100%)。K)細胞骨架熒光染色及L) BMSCs平均擴散面積。M) 干預1天和3天后不同支架組BMSCs的增殖情況。 N)  GP釋放的P2在局部鈣磷基材料和骨組織上的錨定示意圖。
3.3 變換的支架的犧牲模板以創建3D分支通道通過增殖、遷移、成骨分化以及基因和蛋白質表達譜評估復合支架對BMSCs的功能調節作用。根據EdU結果顯示，高糖微環境抑制BMSCs增殖，T組改善效果不佳，TZ組和TZGP組能一定程度恢復其增殖活力，TZGP組尤為顯著(圖4A、B)。Transwell實驗顯示，高糖微環境下BMSCs的遷移能力降低，T、TZ、TZGP支架組細胞遷移能力依次增強(圖4C、D)。β-TCP支架降解后釋放的Ca、P離子可促進BMSCs向細胞表面遷移。刺激并積極募集BMSCs。Zn2+   可以促進BMSCs在早期成骨過程中的粘附和增殖。P2是一種高活性的PTH相關肽，具有強大的募集BMSCs和促進增殖的能力。這使得TZGP在高糖環境中對BMSCs具有卓越的保護能力。通過ALP染色(圖4E、F)、茜素紅S(ARS)染色(圖4G、H)和Von   Kossa染色(圖4I、J)評估高糖成骨誘導培養基中BMSCs的成骨分化情況。RT-qPCR檢測成骨相關基因ALP、OCN、Col-I和RUNX2的表達(圖4K-N)，以免疫熒光結果呈現細胞中RUNX2和OCN的蛋白表達(圖4O-R)。結果表明TZ組成骨誘導能力優于T組，但TZGP組的ALP活性和鈣沉積面積明顯優于TZ組，且更明顯刺激成骨相關基因和蛋白的表達。這種增強的成骨活性可以歸因于幾個方面。首先，TCP支架的降解為BMSCs的成骨分化提供了Ca和P。其次，Zn2+通過促進成骨相關基因的表達，增強成骨分化、膠原合成和礦物質沉積，在成骨分化中發揮重要作用。PTH是一種重要的Ca-P調節劑，參與調節骨形成/吸收的代謝平衡。課題組開發的P2通過在C端引入三重谷氨酸，能夠增強P2尾端羧基與TCP支架上Ca2+的錨定程度，暴露肽活性位點；并在PTH的N端絲氨酸上引入磷酸功能團。這些改進顯著增強了PTH的礦化促進作用，使骨代謝平衡向骨積累方向傾斜。
先前的研究表明，能控釋Zn²⁺的復合支架和PTHrP1功能修飾的支架，分別通過  Wnt/β-catenin和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路促進成骨修復。此外，p38  MAPK信號通路是PTH改善成骨作用的調控途徑。在本研究中，經免疫熒光染色和Elisa實驗驗證，TZGP 支架可顯著上調p-p38  MAPK和β-catenin表達水平，說明Wnt/β-catenin和p38  MAPK通路可能參與TZGP促進成骨修復的過程。因此，本研究通過Ca-P無機材料、Zn2+、P2三重正效應疊加的創新設計，使TZGP支架實現了更高效的成骨作用。 圖 4.  支架對BMSCs募集和成骨分化的影響。A、B)第3天BMSCs的EdU染色和C、D)  Transwell測定。E、F)第14天的ALP染色。G、H)第21天的ARS染色和I、J) Von Kossa染色。BMSCs的K)  OCN、L) Col-I、M) ALP和N)RUNX2的mRNA表達。通過免疫熒光染色檢測BMSCs中O、P)RUNX2和Q、R)  OCN的表達水平。
3.4 TZGP支架促進高糖微環境下HUVECs的血管生成骨組織血管網絡為成骨提供關鍵支持，血管生成對骨組織工程支架再生特性意義重大。高血糖微環境中，過量ROS和AGEs積累致微血管病變，影響糖尿病患者骨缺損部位血管重建。EdU染色(圖5A、B)和Transwell測定(圖5C、D)顯示，高糖組HUVECs增殖和遷移能力受損，T組干預無效，TZ組稍有緩解，TZGP組顯著改善。
劃痕愈合實驗同樣證實了TZGP組HUVECs具有較好的遷移愈合能力(圖5G、H)。管形成實驗顯示，在高G組中僅形成少數血管樣結構，在T和TZ組的HUVECs中形成少量間歇性血管，而在TZGP組中形成豐富的連續血管網(圖5E，F)。說明P2的添加使復合支架具有高效的血管形成能力。免疫熒光實驗顯示，TZGP支架顯著促進細胞中血管生成相關因子CD31、HIF-1α、VEGF的表達(圖5I-N)。qRT-PCR檢測發現TZGP組血管生成相關基因CD31、VEGF、HIF-1α、bFGF的表達水平顯著升高。這些結果表明TZGP支架可以通過上調HIF-1α/VEGF等通路蛋白的表達，促進高糖環境下HUVECs的增殖和遷移，促進血管網絡的構建。
 
圖  5. 支架對HUVECs血管生成分化的影響。A、B)第3天的HUVECs EdU染色和C、D)Transwell實驗。E、F) HUVECs  管腔形成的鑒定。G、H) 劃痕實驗驗證了 HUVECs的遷移修復能力。通過免疫熒光染色檢測HUVECs中I、J)  CD31、K、L)VEGF和M、N)OCN的表達水平。
3.5 TZGP 支架在高糖環境中保護線粒體采用免疫熒光法檢測高糖環境下的DNA損傷情況。結果顯示，High-G組BMSCs和HUVECs中DNA損傷標志物γ-H2AX表達明顯，而細胞核中分裂增殖標志物Ki67的表達明顯下調(圖6A~D、I~L)。TZ組γ-H2AX和Ki67的表達均有所改善，在BMSCs中改善更為明顯，但與對照組仍有明顯差異。TZGP組BMSCs和HUVECs細胞核中γ-H2AX的表達明顯減少，而Ki67的表達較T組和TZ組有所改善。線粒體對維持代謝和骨細胞分化至關重要，高糖卻會破壞其動態穩態。此外，線粒體是細胞內ROS的主要來源，而ROS又是線粒體分裂的強效誘導物，過量的ROS可誘導線粒體分裂。糖尿病介導的Adv過多的ROS產生會影響種植體的骨整合。本研究中的JC-1熒光探針實驗顯示，與High-G組相比，TZ和TZGP組的線粒體膜電位有所改善，尤其是TZGP組，而BMSCs的改善更為顯著(圖6E、F、M、N)。此外，用熒光探針二氫乙錠(DHE)檢測細胞內ROS的表達(圖6G、H、O、P)。與High-G組相比，TZ組BMSCs的ROS生成顯著減少。然而，HUVECs中ROS的積累減少。與其他支架組相比，TZGP組的細胞內ROS生成顯著減少。通過DPPH試驗、ABTS試驗、羥基自由基清除試驗、超氧化物自由基清除試驗、過氧化氫自由基清除試驗和鐵還原抗氧化能力試驗等實驗評估表明ZnONPs具有強大的自由基清除能力。本研究還證實，ZnONPs的添加增強了復合支架清除DPPH和ABST自由基的能力。假設TZ支架中的ZnONPs清除了微環境中的自由基，并中斷了ROS積累引起的正反饋毒性，從而發揮了一定的抗氧化應激作用，部分改善了TZ組細胞的線粒體膜電位并下調了細胞內ROS的產生。Zn2+對BMSCs的增殖和分化有明顯的保護作用，這可能是TZ組BMSCs和HUVECs處理存在差異的潛在原因之一。此外，有證據表明PTH通過增強DNA修復來抑制細胞凋亡。PTHrP可通過其N端和骨抑制結構域減少成骨細胞中的ROS產生，并通過調節MAPK活化來減弱ROS誘導的細胞凋亡。與PTH(1-34)相比，P2顯著減弱了H2O2誘導的BMSCs和HUVECs線粒體損傷和內源性ROS積累。因此，P2和ZnONPs的雙重保護作用可能是TZGP支架減輕高糖誘導的氧化應激對細胞損傷作用的潛在機制。 圖  6. A) BMSCs和B) HUVECs中γ-H2AX的表達。C) BMSCs和D) HUVECs中Ki67的表達。通過JC-1  測定評估E)BMSCs和F)HUVECs的線粒體膜電位。DHE測定評估G)BMSCs和H)HUVECs中的細胞內ROS表達。定量分析I、J)  γ-H2AX、K、L) Ki67、M、N) JC-1和O、P) ROS。
3.6 產生具有行走運動的基于水凝膠的生物混合致動器為研究TZGP復合支架對糖尿病患者的骨再生作用，構建糖尿病骨缺損模型并植入T、TZ和TZGP支架。用鏈脲佐菌素誘導5  -  7天后，SD大鼠成功建模。TZ和TZGP組大鼠血糖略低于T組，推測是支架降解釋放的ZnONPs有輕度降血糖作用，但局部釋藥濃度有限，抗糖尿病效果不顯著。
術后6、12周采用microCT及三維重建分析評估骨修復情況。結果顯示，DM組糖尿病骨缺損部位骨量較少，僅積聚于缺損邊緣，由于缺乏支架支撐，組織向缺損內部遷移緩慢，難以形成新骨。與DM組明顯不同的是，TZGP組骨缺損部位礦化骨組織生成較多，支架表面及間隙中覆蓋更多新生骨。同時，TZGP組支架降解較T組更明顯，促進新生骨組織逐漸爬入(圖7A)。此外，TZGP組在冠狀面、矢狀面及橫斷面支架周圍均可見較多黃綠色骨組織，而T組可見較多藍色支架結構(圖7B)。與這些結果一致的是，TZGP組的骨微結構參數，如骨體積(BV)、骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)明顯優于其他組   (圖7C-E)。三個支架組之間的骨小梁間距(Tb.Sp)沒有顯著差異，但小于對照組(圖7F)。這些結果表明TZGP支架可以顯著促進糖尿病骨缺損中的骨再生。 圖 7. 微型CT修復糖尿病骨缺損的評估。A)局部糖尿病骨缺損的3D重建。B)植入6周和12周時支架周圍新生骨組織的分布。新骨呈黃綠色，支架呈藍紫色。各組治療后骨微結構參數，包括C) BV/TV、D) Tb.N、E) Tb.Th和F) Tb.Sp。 通過在兩個不同的時間間隔進行HE染色，可以更直觀地觀察到三組支架周圍形成了連續的新生組織環。然而，DM組的缺損區域僅覆蓋了一層相對較薄的組織(圖8A)。TZGP組支架降解最多，新生組織豐富，填充在支架周圍和間隙(圖8A、B)，橙色的新生骨組織比其他組更豐富(圖8A)。相比之下，T組支架內部在6周時尚未明顯被新生組織填充(圖8A)。
Masson染色結果與HE結果一致，TZGP組支架內及周圍有更多紅色和藍色的新生骨組織(圖8C、D)。然而，DM組新骨形成很少部分樣本中甚至出現骨缺損邊緣的明顯骨吸收現象。支架中心區域因內部保護作用存在未降解的GP顆粒，而支架-組織界面區域的GP則被包埋組織降解(圖8A、C),這表明明膠微球可通過位置差異實現P2在時間和空間上的緩慢釋放。RUNX2、Col-I、CD31和HIF-1α的IHC染色反映了成骨和血管生成相關因子的表達(圖8E)。RUNX2是早期成骨的重要轉錄因子，其在TZGP組中的表達更為顯著，尤其是在支架-新生組織連接處。這表明TZGP支架保持了良好的成骨活性(圖8E、F)。Col-I是骨組織中的主要膠原成分。與DM和T組相比，TZ和TZGP組形成的膠原結構更豐富、更致密(圖8E、G)。此外，TZGP組中HIF-1α表達更顯著，對成骨和血管生成分化均起正向調控作用(圖8E、J)。CD31標記可見各組支架周圍新生血管(圖8E、H、I)。TZ組血管生成較T組更活躍，且其體內促血管活性顯著優于體外實驗結果(圖5E、8E)。原因是TZ支架改善局部微環境、體內存在細胞間信號串擾，而Zn²⁺可通過調控BMSCs(骨髓間充質干細胞)促進形成新生血管。TZGP組新生血管比TZ組更多，得益于支架控釋P2的促血管生成效應。總之，用ZnONPs和P2修飾的TZGP支架可以加速糖尿病骨缺損的血管生成和成骨修復。 圖  8.  糖尿病骨缺損修復的組織學評估。A)糖尿病骨缺損再生的HE染色。黃色箭頭指向GP。B)12周時T、TZ和TZGP組的支架和新生組織的百分比。與T組相比****p  < 0.0001；與TZ組相比###p <  0.001。C)糖尿病骨缺損再生的Masson三色染色。黃色箭頭指向GP。D)12周時Masson染色結果中新骨面積的百分比。E)植入12周時RUNX2、Col-I、CD31和HIF-1α的IHC染色。箭頭指向新生血管。F)  RUNX2、G) Col-I 和J) HIF-1α相對表達的半定量分析。H)血管面積和I)血管數量的半定量分析。 本研究在細胞和小動物水平驗證了TZGP復合支架的有效性，為進一步推廣至臨床試驗奠定了堅實的基礎，但仍有一些方向需要進一步探索。首先，本研究發現TZGP支架相較于α-TCP支架具有更好的生物降解性，未來的研究可以致力于開發降解速率與骨組織再生同步的支架。其次，雖然我們初步驗證了TZGP能夠調控p38   MAPK和Wnt/β-catenin信號通路，但必須指出的是，復合支架在局部骨缺損區域的影響是多方面的，多種類型的細胞都會受到支架的調控。最后，雖然在支架中引入ZnONPs能夠輕微調節血糖，但后續研究應該進一步探索局部釋放ZnONPs對全身血糖調節的可能和潛在機制。四、結論糖尿病患者的高血糖微環境可引發氧化應激等毒性病理因素，對局部骨再生和骨缺損的血管化修復帶來挑戰。本研究通過P2、ZnONPs和α-TCP三者巧妙組合，構建了一種具有可降解、抗菌、抗氧化、高骨誘導和血管擴張活性的3D打印TZGP復合支架。   這種新型TZGP支架各組分優勢互補，明顯改善了傳統純α-TCP支架降解速度慢、缺乏活性肽、有酸性降解產物等不利因素。體外實驗證實，TZGP支架可改善高糖微環境下BMSC和HUVEC的DNA損傷和線粒體損傷，減少ROS積累。TZGP支架釋放的Zn2+和P2通過促進成骨相關因子RUNX2、OCN、ALP、Col   I的表達，加速成骨分化和鈣鹽沉積；同時，TZGP支架能通過促進VEGF、CD31、bFGF、HIF-1α等生物因子的表達，有效重建血管網絡。體內實驗證實，TZGP復合支架能促進糖尿病骨缺損處的組織填充和骨血管再生。因此，本研究采用的活性肽、金屬離子和無機Ca-P材料相結合的策略，為難治性糖尿病骨缺損的修復提供了一種新的設計。五、參考文獻J.  Wang, Y.Xia, Z. Hao, G. Shi, Q. Zhang, C. Wang, M. Zhu, Y. Huang, L.  Guo, T. Luan, T.Zhu, H. Dai, J. Li, A Triple-Integrated 3D-Printed  Composite Scaffold ofHigh-Activity Peptide-Metal Ion-Bone Cement  Facilitates Osteo-VascularRegenerative Repair of Diabetic Bone Defects.  Adv. Funct. Mater. 2025, 2422950.https://doi.org/10.1002/adfm.202422950

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