3D打印微針陣列貼片可用于小分子、蛋白質和核酸等液態固態皮內給藥
時間：2024-10-15 08:22 來源：EFL生物3D打印與生物制造 作者：admin 閱讀：次
相關研究成果以“3D-Printed Latticed Microneedle Array Patches for Tunable and Versatile Intradermal Delivery”為題于2024年9月2日發表在《Advanced Materials》上。
1.網格微針陣列貼片(L-MAP)庫的系統設計
為了設計L-MAP，系統地改變了針基形狀（三角形、正方形、五邊形、六邊形和圓形）、針中格子層數（1、2和3）以及支柱的錐形尺度等變量（圖1A）。錐形尺度是指每個支撐支柱從基部到尖端的錐形程度，如圖1A所示，錐形尺度越大，最小支柱寬度和最大支柱寬度之間的差異就越大。這三個關鍵變量的組合用于生成不同L-MAP設計組。使用這種設計策略，生成了43個L-MAP設計，并從計算機輔助設計(CAD)文件中計算出空隙體積和支柱表面積（圖1B）。該策略用于探索一系列針頭表面積和空隙體積，以分離具有不同貨物釋放動力學的設計。
為了設計機械完整性（MI）評分，將針頭體積中具有高安全系數 (>6) 的百分比最大化，同時將其預測的最大von Mises應力(GPa)和尖端變形最小化。使用5個樣本L-MAP設計驗證了開發的MI評分系統，并根據MI評分以經驗方式評估了它們的抗壓強度。有三種L-MAP設計的MI評分高于10，而其他設計的MI評分則低一個數量級(圖1C)。根據庫設計和計算機模擬的數據，選擇了最佳L-MAP設計，以便根據圖1D中概述的工作流程進行下游表征并與方形底座實心針狀MAP進行比較。
圖1 生成L-MAP設計庫
2.L-MAP設計的制造和機械特性
隨后，作者對三種下選的L-MAP設計進行了優化，以便在Carbon 3D開發的工業化高分辨率CLIP原型打印機上進行打印。該研究成功在10分鐘內打印出每個補丁的L-MAP（打印尺寸= 5 mm × 8.2 mm × 2 mm），并拍攝了針頭的SEM圖像以顯示針頭的形態和拓撲結構（圖2B）。每片貼片有40根針頭的L-MAP設計在Instron裝置上進行了壓縮測試，以評估失效力和失效模式（圖2C）。所有針頭均因屈曲而非斷裂而失效，這對于避免殘留針頭碎片留在用戶皮膚中的危險非常理想。所有這些失效力均大于每根針∼0.1 N，這是穿透皮膚所需的平均力（圖2D）。使用光學相干斷層掃描(OCT)評估L-MAP在切除的人體皮膚中的穿透深度（圖2E）。總體而言，與實心MAP 相比，這三種L-MAP設計在人體皮膚中的平均穿透深度都更高（圖2Eii）。
圖2 最佳L-MAP設計的3D打印和機械特性
3.L-MAP的固態和液態小分子輸送
為了證明該平臺在小分子固態和液態輸送中的實用性，作者選擇了亞甲藍染料作為模型貨物。對于固態貨物裝載，將貼片浸涂在 0.5 wt/v% 亞甲藍染料和粘度/穩定性增強賦形劑（甲基纖維素和蔗糖）的混合物中。浸涂后，將貼片在室溫下風干1小時（圖3Ai）。一般而言，與尺寸相似的固體MAP相比，L-MAP的貨物裝載量至少增加了2倍，其中Sq 2 Tier L-MAP設計可容納最多的貨物（圖3Aii）。固態貨物裝載量也可以通過增加MAP浸涂層的數量來增加。此外，L-MAP設計的貨物裝載在第三次浸涂后達到穩定狀態。因此，對于后續的固態貨物輸送特性，所有MAP每個貼片都進行了3次浸涂。對于液體輸送，使用類似的浸涂策略，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中將0.5 wt/v% 亞甲藍染料裝入貼片，并量化裝載的液體染料量（圖3B）。從光學顯微鏡圖像中可以看出，L-MAP能夠將液體貨物的液滴截留在空隙中，而固體MAP則無法捕獲任何液體制劑（圖3Bi）。
在水合的、切除的豬皮中評估了每種L-MAP設計的小分子染料輸送動力學。貼片上裝有0.5 wt/v% 亞甲藍染料（固態或液態），并在指定的應用時間內應用于豬耳皮膚活檢。取下貼片后，獲得了輸送到皮膚的染料量，相對于貼片上剩余貨物的百分比。該方法用于評估固態（圖3C）和液態（圖3D）小分子制劑的貨物輸送動力學。考慮到液體貨物的運送，僅評估了L-MAP的釋放曲線，因為液體貨物無法被固體MAP有效捕獲。正如預期的那樣，固態運送的釋放動力學與液態不同（圖3C、D）。對于固態貨物運送，Pent 2 Tier和Sq 3 Tier設計似乎具有相似的釋放動力學，45%的貨物在5分鐘內釋放。Sq 2 Tier設計似乎以稍慢的方式釋放貨物，5分鐘內只有38%的貨物運送。最后，固體MAP釋放貨物最快，5分鐘內貨物運送率為56%。
此外，作者還觀察到液體貨物的釋放動力學隨L-MAP設計的不同而不同，其中Sq 2 Tier 貼片可提供最快、最高效的貨物輸送。超過85%的貨物在5分鐘的應用時間內輸送（圖3D）。綜合以上數據可知LMAP可用于將固態和液態小分子有效載荷有效地輸送到皮膚，具有不同的釋放曲線。
圖3 固態和液態、小分子染料輸送的動力學
4.使用L-MAP進行固態卵清蛋白(OVA)輸送
蛋白質抗原遞送在疫苗領域備受關注，并且已經證明卵清蛋白(OVA)通過MAP遞送是一種有前途的蛋白質抗原和蛋白質治療替代品。因此，作者選擇使用之前報道過的固態OVA蛋白配方，通過L-MAP展示可調節的釋放動力學（圖4A-B）。為了展示不同的釋放曲線，選擇了用不同熒光團（Texas Red 和 AlexaFluor 488）標記的OVA蛋白。首先，在切除的豬皮中評估了每片貼片一個針頭設計L-MAP（Sq 2 Tier 或 Pent 2 Tier）的釋放曲線。使用SEM和熒光顯微鏡驗證分離的Texas Red標記OVA在 Sq 2 Tier針頭上的裝載情況和AlexaFluor 488標記OVA在Pent 2 Tier針頭上的裝載情況（圖4C）。在離體豬皮中證實了單個貼片觀察到的趨勢，其中Sq 2 Tier幾何形狀再次比混合L-MAP上的Pent 2 Tier幾何形狀釋放貨物的速度更快（圖4Di）。去除貼片后，用膠帶剝離皮膚，以量化L-MAP部署期間沉積在皮膚表面的貨物量。再次觀察到，皮膚表面沉積的貨物量極少（<4%），時間點之間沒有顯著差異（圖4Dii）。通過切片組織進一步驗證了這些結果，以可視化每個熒光團標記的OVA蛋白的熒光信號深度。
驗證了不同的釋放動力學曲線后，將混合L-MAP應用于大鼠，時間為10 分鐘、30分鐘、1小時或4小時（圖4Ei）。一般來說，熒光信號可持續長達24小時，大多數信號在移除貼片后48小時消失（圖4Eiii）。與Pent 2 Tier部分相比，混合L-MAP的Sq 2 Tier部分還在更短的時間內釋放了更高百分比的OVA貨物，這進一步證實了在離體豬皮中觀察到的結果（圖4Di）。以上數據表明混合L-MAP可以實現同一類型貨物的不同釋放曲線，并且L-MAP 系統可用于遞送固態OVA蛋白。
圖4 L-MAP OVA蛋白質輸送具有不同的釋放動力學
5.使用L-MAP進行液態mRNA遞送
隨著COVID mRNA疫苗的推出，液態mRNA疫苗在疫苗遞送領域也獲得了關注。為了證明L-MAP平臺在體內皮內液體遞送中的實用性，作者選擇了封裝在D-Lin MC3脂質納米顆粒(LNP)中的螢火蟲熒光素酶(FLuc)mRNA作為治療相關的模型貨物。Sq 2 Tier 設計被選為RNA遞送，因為它具有高空隙率和液態遞送的快速釋放特性（圖3D）。40針Sq 2 Tier L-MAP每貼片可裝載約850 ng FLuc mRNA，每針可裝載20 ng（圖5A）。這種RNA裝載能力與傳統的可溶解和涂層MAP系統相當，但每貼片所需的針頭數量大約是后者的一半（圖5B）。
為了證明可重復的RNA遞送和轉染，作者采用了活體切除豬皮膚模型證明了Sq 2 Tier L-MAP可以遞送貨物并引發局部細胞轉染。在短短1分鐘的應用時間內就觀察到了FLuc蛋白表達（圖 5Ci）。此外，遞送了兩劑量的mRNA，分別為0.4 μg和0.8 μg，并顯示出L-MAP的劑量依賴性。無論貼劑應用時間長短，從較高RNA劑量觀察到的發光信號始終高于較低劑量的發光信號（圖5Cii）。這表明，只需改變裝載溶液中貨物的濃度即可控制遞送劑量。然后通過L-MAP將FLuc mRNA LNPs注入活體動物體內。將載有液體mRNA LNP 的L-MAPs應用于大鼠5分鐘或1小時，并使用空貼片作為陰性對照（圖5Di）。通過評估貼片上剩余的RNA，確定在短短5分鐘的應用時間內，大約50%的裝載液體貨物已經釋放（圖5Dii）。在更長的應用時間（1小時）實現了75%的貨物輸送。與現有的 RNA MAP 系統相比，輸送效率大約高出兩倍。
此外，在所有使用液體FLuc mRNA 輸送的Sq 2 Tier L-MAP中都觀察到了穩健的轉染和蛋白質表達（圖5Diii）。早在去除貼片后3小時就觀察到發光信號，去除L-MAP后24小時達到峰值，72小時減弱，顯示出典型的mRNA組織轉染特征（圖5Div）。通過這些結果，證明了L-MAP液體RNA在大鼠中的高效和可重復性遞送，并因此實現了強勁的蛋白質表達。
圖5 Sq 2 Tier L-MAP可運送液體RNA貨物并轉染細胞
在這項工作中，作者利用高分辨率打印機來擴展L-MAP的多功能性和可調性，并運送大量固態和液態貨物。所設計的新型L-MAP結構帶有錐形支柱，可以幫助保持更大的空隙體積，同時在晶格針頭內提供機械完整性。此外，L-MAP可以成為相關治療貨物（小分子、蛋白質和核酸）的液態和固態輸送的平臺技術。這項工作有望將藥物輸送（尤其是多種有效載荷的輸送）擴展到皮內空間。L-MAP平臺引入的模塊化為多種有效載荷開辟了藥物遞送方案。然而，一個潛在的限制是確保在更短的佩戴時間內實現更高的遞送效率。希望通過整合可以產生快速、高效遞送方案的設備設計元素，擴展這項工作，以在未來的研究中展示L-MAP的治療潛力。
文章來源：
https://doi.org/10.1002/adma.202404606
(責任編輯：admin)
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